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  • 關于色譜柱的新手使用問題解答

    更新時間:2021-06-24  點擊次數:1707
      色譜柱的新手使用問題解答:
     
      1.對于一根常用的C18柱,拿到一根新柱的時候應該怎樣進行活化及維護?為什么要這樣做?
     
      答:新柱活化,實際上是一個平衡的過程,除了用流動相平衡外,有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡,特別是測定分子量比較高的多肽,尤其重要。因為分子量高的物質分子,擴散速度慢,平衡所需時間也相應較長。具體平衡方式也很簡單,多進幾次樣品,直到峰面積和保留時間穩定,再進行正式進樣測定。
     
      如果要加快平衡時間,把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續進樣多針。用待測物對新柱平衡,目的是將硅膠基質填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。
     
      2.測定多肽,一般采用什么柱子?流動相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,應該怎么選擇柱子?
     
      答:分子量不高的多肽一般選用常規C18柱能測定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。
     
      3.氨基柱在進酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復?
     
      答:氨基柱測酸性樣品,應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化,導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現在柱效下降。建議:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。
     
      4.色譜柱的技術都有哪些?比如封尾等,這些技術在應用時都體現在哪里?
     
      答:色譜柱技術包括填料技術和裝柱技術,填料技術自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術也沒有想象中的這么簡單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內徑和長度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩定、均一的柱床,更多是一門藝術,需要經驗積累。
     
      國內和國外想比,我認為色譜柱的差距在于:國內公司以前都不會自己開發填料,一般買國外現成填料裝柱,買到的填料質量控制權不在自己手里。另外因為裝柱歷史短,經驗積累少,裝柱工藝也沒有達到較高水平。另外,對色譜柱性能很關鍵的基礎材料-----裸硅膠,國產的還不過關,在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產品相比,差距很大。
     
      5.色譜柱技術的差距在哪里?
     
      答:液相色譜柱裝填實際上是有一定技巧和程序,可能還有一些運氣。一般使用高壓勻漿方法裝填。也是能讓填料在溶劑內均勻地懸浮。然后用瞬間高壓壓實,這實際上用到了不同比例的勻漿液體,和合適的壓力。壓力太大,顆粒破碎,壓力太小,塔板數少。同時壓力需要穩定,不然分布不均,拖尾嚴重。同時還有頭上平整程度。套上套,可以用了。
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